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补充PCR范围,我们的测定和储存微孔板支持各种应用,包括基于细胞的含量筛选和ELISA,荧光,发光和样品收集。118金宝搏app
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用于PCR和存储的低结合孔板
聚丙烯(PP)是PCR管的最佳塑料材料,因为它是化学惰性的,耐溶剂,并且适用于注塑成型 - 允许生产薄壁管以获得最佳PCR结果。
尽管这种材料具有非常疏水的性质,但DNA已被证明可以与PP管结合,特别是在高离子强度下。不同的PP聚合物用于生产PCR消耗品,由于它们的特性不同,包括表面电荷,因此它们以不同的数量结合DNA。
与PP表面的DNA结合通常仅是反应管和储存容器的问题,但不适用于PCR / QPCR管。在变性步骤期间释放到管壁的DNA和/或仍然可用于扩增。
然而,由于进展体积小型化和具有新技术,例如下一代测序(NGS),越来越多地推荐用于可能需要超低DNA结合的其他应用的PCR / QPCR管。
- 低结合特征由选定的低粘合聚合物产生,没有涂层用于达到结合特性
- 样品没有污染或修改
- 在宽温度范围内进行测试
- 低温保存和高温培养后,DNA回收率最高
- 在NGS样品制备和图书馆建设中孵育步骤和样品转移时没有DNA损失
- 非常适用于具有超低DNA输入的敏感应用
实验数据
线性DNA与不同PP聚合物的结合
实验装置
产生十倍DNA稀释系列含有线性1176bp产物(从质粒acta1,Ta克隆到PGEMT载体中消化)产生的DNA浓度为10ng /μl,1ng /μl,0.1ng /μl和0.010ng /μl。
将50μl的每种DNA浓度施加到PCR板上,并在37℃温育30分钟。然后将DNA转移到PCR板的下一排,再孵育30分钟。该程序重复七次,使DNA在8个不同的管中孵育共240分钟。所有转移步骤均用市售的低绑定尖端(康宁)进行。
随后使用IdT(集成DNA技术)设计的ACTA1引物和探针,对每种DNA浓度的µl进行qPCR分析,并与原始稀释序列的2µl进行比较(每次qPCR运行总DNA输入= 2 ng到0.002 ng)。
实验结果
比较了三块不同的PCR板:
- a)具有由4抗性低结合PP聚合物制成的管的PCR板
- b)具有由替代PP聚合物制成的管的PCR板和
- c)来自竞争对手的低绑定板
图2为不同DNA浓度下的Ct值。蓝线为未在PCR管中培养的对照DNA的结果,红线为PCR管中培养的结果。δ ct用绿色表示。
对于不结合任何可检测的DNA迹线的塑料材料,红色和蓝线应该是相同的(对于Δct= 0),其不结合任何可检测的DNA痕迹(缩小差异可能导致移液不准确)。
4抗性低结合材料(A)显示几乎是理想的图案,唯一具有0.44循环的较小偏差为0.002ng /μl的最低DNA浓度为0.44个循环。
平行测试的替代内部PP聚合物(b)显示,在最低DNA浓度下,DNA结合的δ ct高达2.57个周期。从竞争对手E (c)的“低结合”PCR板上获得了一个惊人的相似模式,δ ct高达2.92个周期。
结果清楚地显示了4度低结合PP聚合物的优越性能,表明了敏感应用的优势,如下一代测序样品制备。
基因组DNA与不同温度低结合PP聚合物的结合
对四自由度低结合PP聚合物进行了进一步的实验。
使用小鼠基因组DNA(溶解在5mm Tris-HCl pH8.0)代替Acta1片段中的相同实验条件重复上述实验,代替acta1片段测试三种不同的孵育温度(4°C,作为反应混合物的典型储存温度,37°C作为酶反应的典型温度,65℃作为酶变性的典型温度)。使用Kapa Sybr Fast QPCR主混合物进行QPCR比较,具有相同的DNA浓度。
图3显示了从4℃温育所取的示例性标准曲线,显示出4种不同的输入浓度的CT值,用于孵育的样品与对照。其他温度的结果是可比的。
表1显示了所有不同实验条件的CT值 - 确认在8种不同的管中孵育的样品之间的几乎没有差异,总共240分钟,并且对照未进行PCR塑料表面。
Ct值 | CT SD. | ΔCt | |
孵化温度:4°C | |||
20 ng / rxn | 没有孵化19.97. | 没有孵化0.01 | -0.2 |
孵化19.77后 | 孵化后0.01 | ||
2 ng / rxn | 没有孵化22.93 | 没有孵化0.08 | -0.06. |
孵育22.87后 | 孵化后0.05 | ||
0.2 ng / rxn | 没有孵化26.44. | 没有孵化0.03 | -0.06. |
孵育后26.38 | 孵化后0.05 | ||
0.02 ng / rxn | 没有孵化29.61. | 没有孵化0.14 | 0.25 |
孵化后29.86 | 孵育0.10 | ||
孵化温度:37°C | |||
20 ng / rxn | 没有孵化19.85. | 没有孵化0.02 | -0.21 |
孵化后19.64 | 孵化后0.05 | ||
2 ng / rxn | 没有孵化22.93 | 没有孵化0.06 | -0.16 |
孵育22.77后 | 孵化后0.05 | ||
0.2 ng / rxn | 没有孵化26.28. | 没有孵化0.03 | 0.10 |
孵育后26.37 | 孵化后0.05 | ||
0.02 ng / rxn | 没有孵化29.49 | 没有孵化0.45 | 0.08 |
孵育29.57后 | 孵化后0.36 | ||
孵化温度:65°C | |||
20 ng / rxn | 没有孵化18.51. | 没有孵化0.04 | -0.73 |
孵化后17.78 | 孵化后0.01 | ||
2 ng / rxn | 没有孵化21.41. | 没有孵化0.003 | -0.16 |
孵化后21.26 | 孵化后0.02 | ||
0.2 ng / rxn | 没有孵化24.69. | 没有孵化0.13 | -0.18 |
孵化后24.51 | 孵化后0.03 | ||
0.02 ng / rxn | 没有孵化28.57 | 没有孵化0.23 | -0.42 |
孵化后28.15 | 孵化后0.56 |
表格1:基因组DNA在不同温度下的低结合PP聚合物的结合 - 所有不同实验条件的CT值
实验数据:通过我们的日本合作伙伴Nippon Genetics友好提供不同温度下DNA粘附的数据。
以下的低绑定板可订购现货,但额外的超低绑定性能的产品可根据要求提供。阅读少▲